Kehl, Alexander
(2008)
Konformationsänderungen im Zebrafisch-GCAP4.
UNSPECIFIED.
Abstract
Die Guanlylate Cyclase-activating Proteins (GCAPs) stellen eine Subfamilie der Neuronal Calcium Sensor (NCS)-Proteine dar. Diese wiederum gehören zur Superfamilie der EF-Hand-Calcium-Bindungsproteine. Von den vier EF-Händen ist bei NCS-Proteinen die erste nicht funktionell. Zudem sind die NCS-Proteine überwiegend N-Terminal myristoyliert. Beides gilt auch für GCAPs. Bisher wurden neun Mitglieder der GCAP-Familie entdeckt. Neben den länger bekannten GCAP1-3 wurden kürzlich im Zebrafisch die zapfenspezifischen GCAP4, 5 und 7 (zGCAPs) entdeckt. Wohingegen gerade GCAP1-2 gut charakterisiert sind, ist über die zGCAPs wenig bekannt. Über GCAP1-2 ist bekannt, dass sie calciumabhängige Konformationsänderungen eingehen und ihr Zielenzym, die Gyanylate Cyclase (GC), calciumabhängig regulieren. Bei hohen intrazellulären Calciumkonzentrationen inhibieren sie die GC, bei niedrigen aktivieren die GCAPs sie. Damit spielen sie eine wichtige Rolle in der Phototransduktion und Lichtadaptation. Auch bei zGCAP4 konnten mittlerweile calcium-abhängige Konformationsänderungen und eine calciumabhängige Regulation der GC gezeigt werden.
Durch die heterologe Expression in E. coli und Reinigung von bGCAP2 konnte in dieser Arbeit zunächst ein Referenzprotein gewonnen werden. Im Anschluss wurde zGCAP4 als Wildtyp, als A6S-Mutante (zur hinreichenden Myristoylierung) und als myristoylierte Mutante ebenso in ausreichenden Mengen gewonnen.
Mit dem gereinigten zGCAP4 konnten dann verschiedene Experimente zu calciumabhängigen Konformationsänderungen durchgeführt werden. Zum einen wurde die elektrophoretische Mobilität von zGCAP4 untersucht. Diese war unter Calciumeinfluss auch wie bei den bisher untersuchten GCAPs höher. Allerdings war dieser so genannte Calcium-Shift nicht so ausgeprägt wie bei den bisherigen GCAPs. Zum anderen wurden limitierte Proteolysen mittels Trypsin durchgeführt. Diese verliefen, ähnlich zu bisherigen GCAPs, ohne Calcium wesentlich schneller als mit Calcium. Allerdings war der Verdau der zGCAP4-Varianten ohne Calcium bedeutend langsamer als bei anderen GCAPs. Außerdem wurde der Dimerisierungsgrad von zGCAP4 mittels SEC analysiert. Es konnte bei allen zGCAP4-Varianten ohne Calcium ein höherer Dimerisierungsgrad beobachtet werden. Das Verhalten ähnelt in diesem Punkt mehr dem von bGCAP2 als dem von bGCAP1, wenn auch der Dimer-Anteil deutlich geringer als der bei bGCAP2 ist.
Insgesamt zeigen somit alle Experimente, dass zGCAP4 (in allen seinen Varianten) ebenso wie alle anderen bisher untersuchten GCAPs calciumabhängige Konformationsänderungen eingeht. Dies stützt schon bisher gewonnene Daten, die ebenfalls darauf hindeuteten.
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